線粒體復(fù)合體Ⅰ試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                     微量法100管/96樣

注   意 ：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

復(fù)合體Ⅰ（EC 1.6.5. 3）又稱NADH-CoQ 還原酶或NADH脫氫酶，廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中，是線粒體內(nèi)膜中最大的蛋白復(fù)合物。該酶催化一對(duì)電子從NADH傳遞給CoQ，同時(shí)可使O₂還原生成O^2.-，是呼吸電子傳遞鏈上產(chǎn)生O^2.-的主要部位。測(cè)定該酶活性，不僅可以反映呼吸電子傳遞鏈（ETC）狀態(tài)，而且可以反映活性氧（ROS）生成狀態(tài)。

測(cè)定原理：

復(fù)合體Ⅰ能夠催化NADH脫氫生成NAD⁺，在340nm下測(cè)定NADH的氧化速率計(jì)算出該酶活性的大小。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

試劑一：液體100mL×1瓶，-20℃保存；

試劑二：液體20mL×1瓶，-20℃保存；

試劑三：液體1.5mL×1瓶，-20℃保存；

試劑四：液體25mL×1瓶，-20℃保存；

試劑五：液體1mL×1支，-20℃保存；

試劑六：粉劑×1支，-20℃保存，用時(shí)加入2mL蒸餾水；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

工作液的配制：臨用前將試劑五轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

樣本的前處理：

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

①        準(zhǔn)確稱取0.1g組織或收集500萬(wàn)細(xì)胞，加入1mL試劑一和10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

②        將勻漿600g，4℃離心5min。

③        棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。

④        上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅰ（此步可選做）。

⑤        步驟④中的沉淀即為線粒體，加入200uL試劑二和2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10秒，重復(fù)30次），用于復(fù)合體Ⅰ酶活性測(cè)定。

測(cè)定步驟：

1、  分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、  樣本測(cè)定

（1）工作液于37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）孵育5min。

（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、200μL工作液和15μL試劑六，混勻，記錄340nm處初始吸光值A1和 2min后的吸光值A2，計(jì)算ΔA=A1-A2。

復(fù)合體Ⅰ活力單位的計(jì)算：

a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下：

（1）按蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

 復(fù)合體Ⅰ活力（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=1808×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2） 按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

 復(fù)合體Ⅰ活力（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=365×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

復(fù)合體Ⅰ活力(nmol/min/10⁴ cell)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.73×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，2.25×10^-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2 min；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬(wàn)。

b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下：

（1）按蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

 復(fù)合體Ⅰ活力（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=3616×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2） 按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

 復(fù)合體Ⅰ活力（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=730×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

復(fù)合體Ⅰ活力（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=1.46×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，2.25×10^-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2 min；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬(wàn)。