果糖-6-磷酸激酶（6-phosphofructokinase，PFK）試劑盒說明書

                                               微量法100管/96樣

注   意 ：正式測定前務(wù)必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

PFK（EC 2.7.1.11）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，負責將果糖-6-磷酸和ATP轉(zhuǎn)化為果糖-1,6二磷酸和ADP，是糖酵解過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶之一。

測定原理：

PFK催化果糖-6-磷酸和ATP生成果糖-1,6-二磷酸和ADP，丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶進一步依次催化NADH氧化生成NAD⁺，在340nm下測定NADH下降速率，即可反映PFK活性。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：100mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體20mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1瓶，-20℃保存；

試劑三：粉劑×1支，4℃保存；

試劑四：液體8μL×1支，4℃保存；

樣本的前處理：

1、細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為1000~5000：1的比例（建議2000萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

3、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、  分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、  樣本測定

（1）在試劑二瓶中加入17mL試劑一和1.13mL蒸餾水充分溶解，置于37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴5min；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

（2）在試劑三中加入1mL蒸餾水充分混勻，冰上放置備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

（3）在試劑四中加入1mL蒸餾水充分混勻，冰上放置待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍

融；

（4）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、10μL試劑三、10μL試劑四和170μL試劑二，混勻，立即記錄340nm處20s時的吸光值A1和 10min20s后的吸光值A2，計算ΔA=A1-A2。

注意：不同勻漿組織中PFK活力不一樣，做正式試驗之前請做1-2只預試，若ΔA>0.5，則說明活力太高，必須用提取液稀釋成適當濃度勻漿上清液（計算公式中乘以相應稀釋倍數(shù)），或縮短反應時間至2min或5min,使ΔA<0.5，以提高檢測靈敏度。

PFK活力單位的計算

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、血清（漿）PFK活力的計算:

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP轉(zhuǎn)化為1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定義為一個酶活力單位。

PFK（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=321×ΔA

2、組織、細菌或細胞中PFK活力計算：

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP轉(zhuǎn)化為1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定義為一個酶活力單位。

PFK（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=321×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織每分鐘催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP轉(zhuǎn)化為1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定義為一個酶活力單位。

PFK（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=321×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP轉(zhuǎn)化為1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定義為一個酶活力單位。

PFK（nmol/min /10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(2000×V樣÷V樣總)÷T=0.1605×ΔA

V反總：反應體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，10 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；2000：細菌或細胞總數(shù)，2000萬。

b.用96孔板測定的計算公式如下

1、血清（漿）PFK活力的計算:

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP轉(zhuǎn)化為1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定義為一個酶活力單位。

PFK（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=642×ΔA

2、組織、細菌或細胞中PFK活力計算：

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP轉(zhuǎn)化為1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定義為一個酶活力單位。

PFK（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=642×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織每分鐘催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP轉(zhuǎn)化為1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol

ADP定義為一個酶活力單位。

PFK（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=642×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP轉(zhuǎn)化為1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定義為一個酶活力單位。

PFK（nmol/min /10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(2000×V樣÷V樣總)÷T=0.321×ΔA

V反總：反應體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，10 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；2000：細菌或細胞總數(shù)，2000萬。