單胺氧化酶（Monoamine Oxidase，MAO）試劑盒說(shuō)明書

                                                      微量法100T/96S

注    意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

MAO(EC1.4.3.4) 主要存在于脊椎動(dòng)物的各種器官，特別是分泌腺、腦、肝臟，在無(wú)脊椎動(dòng)物、豆類的芽等植物中也存在催化單胺類物質(zhì)代謝，含量較低，具有重要的生理功能，其活性能反映肝纖維化的程度。此外，MAO活性異常導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)出現(xiàn)紊亂，從而引發(fā)多種病癥。

測(cè)定原理：

MAO催化單胺類底物脫氨生成相應(yīng)的醛，進(jìn)一步氧化成酸；底物在360nm處有特征吸收峰，測(cè)定360nm光吸收下降的速率，計(jì)算MAO活性。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：

天平、低溫離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液一：液體100mL×1瓶，4℃保存。

提取液二：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體120mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體2mL×1管，4℃避光保存。

粗酶液提取：

1.        稱取約0.1g樣品，加1 mL預(yù)冷的提取液一充分冰浴勻漿，1000g，4℃，離心10min，棄沉淀；把上清轉(zhuǎn)移到另一預(yù)冷的離心管，10000g，4℃，離心30min，棄上清；加入1mL預(yù)冷的提取液二，震蕩混勻，16000g，4℃，離心40min，棄上清；沉淀加入預(yù)冷的1mL 試劑一，震蕩混勻，即粗酶液（可用于可溶性蛋白濃度測(cè)定）。

2.        細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后10000g，4℃，離心10min，棄沉淀；把上清轉(zhuǎn)移到另一預(yù)冷的離心管，10000g，4℃，離心30min，棄上清；加入1.0 mL預(yù)冷的提取液二，震蕩混勻，16000g，4℃，離心40min，棄上清；沉淀加入預(yù)冷的1.0 mL 試劑一，震蕩混勻，即粗酶液（可用于可溶性蛋白濃度測(cè)定），取上清置于冰上待測(cè)。

3.        血清：直接測(cè)定。

測(cè)定操作表：

1、   分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至360nm。

2、   操作表

注意：空白管只需測(cè)定一次。

MAO活性計(jì)算公式：

a．用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、按蛋白含量計(jì)算

酶活定義：37℃，pH7.6時(shí)，每毫克蛋白質(zhì)1min內(nèi)轉(zhuǎn)化1 nmol底物的酶量為一個(gè)酶活單位。

DAO活性（nmol/min / mg prot）= ×V反總÷（V樣× Cpr）÷T= 114×ΔA÷Cpr

2、按樣本質(zhì)量計(jì)算：

酶活定義：37℃，pH7.6時(shí)，每克樣品1min內(nèi)轉(zhuǎn)化1 nmol底物的酶量為一個(gè)酶活單位。

DAO活性（nmol/min / g 鮮重）=×V反總÷（V樣÷V樣總×W）÷T = 114×ΔA÷ W

3、按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活定義：37℃，pH7.6時(shí)，每104個(gè)細(xì)胞1min內(nèi)轉(zhuǎn)化1 nmol底物的酶量為一個(gè)酶活單位。

DAO活性（nmol/min / 104 cell）= ×V反總÷（V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量）÷T

= 114×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量

4、按照液體體積計(jì)算

酶活定義：37℃，pH7.6時(shí)，每升血清1min內(nèi)轉(zhuǎn)化1 nmol底物的酶量為一個(gè)酶活單位。

DAO活性（nmol/min /L）=×V反總÷V樣=114×ΔA

ε：底物摩爾消光系數(shù)，1460L /mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；V樣：反應(yīng)中樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；T：反應(yīng)時(shí)間，60min，W：樣本質(zhì)量，g

b．用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、按蛋白含量計(jì)算

酶活定義：37℃，pH7.6時(shí)，每毫克蛋白質(zhì)1min內(nèi)轉(zhuǎn)化1 nmol底物的酶量為一個(gè)酶活單位。

DAO活性（nmol/min / mg prot）= ×V反總÷（V樣× Cpr）÷T= 228×ΔA÷Cpr

2、按樣本質(zhì)量計(jì)算：

酶活定義：37℃，pH7.6時(shí)，每克樣品1min內(nèi)轉(zhuǎn)化1nmol底物的酶量為一個(gè)酶活單位。

DAO活性（nmol/min / g 鮮重）=×V反總÷（V樣÷V樣總×W）÷T = 228×ΔA÷ W

3、按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活定義：37℃，pH7.6時(shí)，每104個(gè)細(xì)胞1min內(nèi)轉(zhuǎn)化1nmol底物的酶量為一個(gè)酶活單位。

DAO活性（nmol/min / 104 cell）= ×V反總÷（V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量）÷T

= 228×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量

4、   按照液體體積計(jì)算

酶活定義：37℃，pH7.6時(shí)，每升血清1min內(nèi)轉(zhuǎn)化1nmol底物的酶量為一個(gè)酶活單位。

DAO活性（nmol/min /L）=×V反總÷V樣=228000×ΔA

ε：底物摩爾消光系數(shù)，1460L /mol /cm； d：96孔板光徑，0.5cm；V反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；V樣：反應(yīng)中樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；T：反應(yīng)時(shí)間，60min，W：樣本質(zhì)量，g

注意事項(xiàng)：

1、吸光度變化應(yīng)該控制在0.01～0.8之間。否則加大樣品量或稀釋樣品，注意計(jì)算公式中參與計(jì)算的稀釋倍數(shù)要相應(yīng)改變。

2、樣品蛋白質(zhì)含量需要另外測(cè)定。