酰基轉(zhuǎn)移酶（alcohol acyl transferase，AAT）活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                                    微量法100管/96樣

注   意 ：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

AAT是一個(gè)多功能蛋白大家族，主要負(fù)責(zé)催化生物體內(nèi)各種酰基化和去酰基化反應(yīng)，在基因表達(dá)、代謝和信號(hào)傳導(dǎo)中具有重要作用。

測(cè)定原理：

AAT催化乙酰CoA轉(zhuǎn)移乙酰基到丁醇，釋放的CoA還原DTNB生成TNB；TNB在412nm有吸收峰，測(cè)定412 nm吸光度增加速率可計(jì)算AAT活性。

自備儀器和用品：

研缽、冰、臺(tái)式離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋、無(wú)水乙醇。

試劑組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體20mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1瓶，-20℃保存。

試劑三：粉劑×1支，4℃避光保存。

粗酶液提取：

1.        組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測(cè)。

2.        細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

3.        液體：直接檢測(cè)。

AAT測(cè)定操作：

1、分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到412 nm，蒸餾水調(diào)零。

2、工作液的配制：臨用前在試劑二瓶中加入18mL試劑一，充分混勻待用。用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

3、試劑三的配制：臨用前加無(wú)水乙醇1mL充分溶解待用，用不完的試劑4℃保存。

4、 空白管：在Ep管或96孔板中加入10μL提取液和180μL工作液，充分混勻，35℃反應(yīng)15min，加入10μL試劑三，充分混勻，25℃靜置10min，測(cè)定412nm處吸光值，記為A空白管。

5、 測(cè)定管：在Ep管或96孔板中加入10μL樣本和180μL工作液，充分混勻，35℃反應(yīng)15min，加入10μL試劑三，充分混勻，25℃靜置10min，測(cè)定412nm處吸光值，記為A測(cè)定管。△A=A測(cè)定管- A空白管，空白管只要做一管。

AAT活性計(jì)算：

a. 使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1）按照蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個(gè)酶活單位。

AAT (nmol/min/mg prot) = △A ÷（×d）×V反總÷（V樣×Cpr）÷T = 98.04×△A÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個(gè)酶活單位。

AAT (nmol/min /g 鮮重) = △A ÷（×d）×V反總÷(W×V樣÷V樣總) ÷T = 98.04×△A÷W

（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個(gè)酶活單位。

AAT (nmol/min/10⁴cell) = △A ÷（×d）×V反總÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總) ÷T= 98.04×△A÷ 細(xì)胞數(shù)量

（4）按液體體積計(jì)算

活性單位定義：每毫升樣品每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個(gè)酶活單位。

AAT (nmol/min/mL) = △A ÷（×d）×V反總÷V樣÷T = 98.04×△A

：TNB消光系數(shù)，13600L/mol/cm；d：比色皿光徑：1cm；V反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，0.01mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：蛋白含量，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，15 min。

b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1）按照蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個(gè)酶活單位。

AAT (nmol/min/mg prot) = △A ÷（×d）×V反總÷（V樣×Cpr）÷T =196.08×△A÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個(gè)酶活單位。

AAT (nmol/min /g 鮮重) = △A ÷（×d）×V反總÷(W×V樣÷V樣總) ÷T = 196.08×△A÷W

（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個(gè)酶活單位。

AAT (nmol/min/10⁴cell) = △A ÷（×d）×V反總÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總) ÷T=196.08×△A÷ 細(xì)胞數(shù)量

（4）按液體體積計(jì)算

活性單位定義：每毫升樣品每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個(gè)酶活單位。

AAT (nmol/min/mL) = △A ÷（×d）×V反總÷V樣÷T = 196.08×△A

：TNB消光系數(shù)，13600L/mol/cm；d：96孔板光徑：0.5cm；V反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，0.01mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：蛋白含量，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，15min。