單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法100T/96S

注　意：正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

MDHAR 催化 MDHA 還原生成 AsA，在抗壞血酸氧化還原代謝中具有重要作用。

測(cè)定原理：

MDHAR 催化 NADH 還原 MDHA 生成 AsA 和 NAD⁺，NADH 在 340 nm 有特征吸收峰，但是 NAD⁺沒(méi)有。通過(guò)測(cè)定 340 nm 光吸收下降速率，來(lái)計(jì)算出 MDHAR 活性。

實(shí)驗(yàn)中所需儀器及設(shè)備：

研缽、冰、臺(tái)式離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板、可調(diào)式移液槍和雙蒸水

試劑組成和配置：

試劑一：液體 100mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：液體 20mL×1 瓶，室溫保存。

試劑三：粉劑×1 瓶（棕色），4℃保存。臨用前加入 3 mL 蒸餾水充分溶解。

試劑四：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入 2.5 mL 蒸餾水充分溶解。

試劑五：液體 15μL×1 瓶，4℃保存。臨用前加 3 mL 試劑二充分溶解。

粗酶液提取：

1.        組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心 10min，取上清置冰上待測(cè)。

2. . 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：試劑一體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建

議 500 萬(wàn)細(xì)胞加入 1mL 試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；8000g ，4℃離心 20min，取上清液置冰上混勻待測(cè)。

3.        血清等液體：直接測(cè)定。

MDHAR 測(cè)定操作：

1.    分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 340 nm，蒸餾水調(diào)零。

2.    試劑二在 25℃水浴鍋中預(yù)熱 30 min。

3.依次在微量石英比色皿/96 孔板中加入 20μL 試劑三、20μL 試劑四、20μL 試劑五和 120μL 試劑二，最后加入 20μL 上清液，迅速混勻后于 340nm 比色，記錄 30s 和 150s 的吸光值 30s

和 150s 的吸光值 A1 和 A2，△A=A1-A2。

MDHAR 活性計(jì)算公式：

a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

MDHAR 活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1 個(gè)酶活單位。 MDHAR (nmol/min /mg prot) = △A÷ε÷d×V 反總×10⁹]÷（Cpr×V 樣）÷T

= 804×△A ÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

MDHAR 活性單位定義：25℃中每克樣本每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1U。 MDHAR (nmol/min /g 鮮重) = △A÷ε÷d×V 反總×10⁹]÷（W×V 樣÷V 樣總）÷T

= 804×△A ÷W

（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

MDHAR 活性單位定義：25℃中每 10⁴ 個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化 1nmol NADH  為 1 個(gè)酶活單位。

MDHAR (nmol/min/10⁴ cell) = △A÷ε÷d×V 反總×10⁹÷（細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總）÷T = 804×△A ÷ 細(xì)胞數(shù)量

（4）按液體體積計(jì)算

MDHAR 活性單位定義：25℃中每毫升液體每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1 個(gè)酶活單位。 MDHAR (nmol/min /mL) = △A÷ε÷d×V 反總×10⁹÷V 樣）÷T

= 804×△A

ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6220 L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL=2×10^-4L；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL=0.02mL；V 樣總：提取液體積，

1  mL；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL，蛋白質(zhì)濃度需要另外測(cè)定，建議使用本公司蛋白質(zhì)含量 BCA 試劑盒；W ：樣品質(zhì)量；T：反應(yīng)時(shí)間，2min。

b.使用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下：

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

MDHAR 活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1 個(gè)酶活單位。 MDHAR (nmol/min /mg prot) = △A÷ε÷d×V 反總×10⁹]÷（Cpr×V 樣）÷T

= 1608×△A ÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

MDHAR 活性單位定義：25℃中每克樣本每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1U。 MDHAR (nmol/min /g 鮮重) = △A÷ε÷d×V 反總×10⁹]÷（W×V 樣÷V 樣總）÷T

= 1608×△A ÷W

（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

MDHAR 活性單位定義：25℃中每 10⁴ 個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1 個(gè)酶活單位。 MDHAR (nmol/min/10⁴ cell) = △A÷ε÷d×V 反總×10⁹÷（細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總）÷T

= 1608×△A ÷  細(xì)胞數(shù)量

（4）按液體體積計(jì)算

MDHAR 活性單位定義：25℃中每毫升液體每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1 個(gè)酶活單位。 MDHAR (nmol/min /mL) = △A÷ε÷d×V 反總×10⁹÷V 樣）÷T

=1608×△A

ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6220 L/mol/cm；d：96 孔板光徑，0.5cm；V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL=2×10^-4L；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL=0.02mL；V 樣總：提取液體積，1 mL；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL，蛋白質(zhì)濃度需要另外測(cè)定，建議使用本公司蛋白質(zhì)含量 BCA 試劑盒；W ：樣品質(zhì)量；T：反應(yīng)時(shí)間，2min。

注意事項(xiàng)：

臨用前配制的試劑未使用完的 4℃保存，3 天內(nèi)使用完。