中性蛋白酶（Neutral protease, NP）活性測定試劑盒說明書

                                                 微量法 100T/48S

注    意：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義：

NP在一定的溫度和中性pH條件下，催化水解蛋白質(zhì)。由于其安全無毒、水解能力強(qiáng)、作用范圍廣等特點(diǎn)，中性蛋白酶常用于食品、飼料、化妝品和營養(yǎng)保健品生產(chǎn)。

測定原理：

中性條件下，NP催化酪蛋白水解產(chǎn)生酪氨酸；在堿性條件下，酪氨酸還原磷鉬酸化合物生成鎢藍(lán)；在680nm有特征吸收峰。        

自備儀器和用品：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96孔板、水浴鍋、磁力攪拌器、可調(diào)式移液槍、1.5 mL EP管和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加4mL蒸餾水溶解。

試劑三：粉劑×1瓶，4℃避光保存。臨用前加入10mL試劑一，沸水浴中磁力攪拌溶解。（可在燒杯上蓋一層保鮮膜，注意觀察，避免水分全部蒸發(fā)，一般加熱15-30分鐘，該試劑為過飽和試劑，充分混勻后仍出現(xiàn)顆粒物不溶物不影響使用）。

試劑四：粉劑×1瓶， 4℃保存。臨用前加20mL蒸餾水溶解。

試劑五：液體4mL×1瓶，4℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)品：液體1mL×1支，0.25μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液，4℃保存。

粗酶液提取：

1.        組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）冰浴勻漿，8000g，4℃離心10min，取上清，即粗酶液。

2.        血清或培養(yǎng)液：直接測定。

3.        細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。

測定操作：

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長到680 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二、試劑三和試劑四置于30℃水浴保溫30min。

3. 對照管：取0.5 mL EP管，加入20μL粗酶液，40μL試劑二，混勻后置于30℃水浴保溫10min；加入40μL試劑三，混勻后8000g，4℃離心10min；取40μL上清液，加入新的EP管，再加入200μL試劑四，40μL試劑五，混勻后置于30℃水浴保溫20min，取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板，于680nm測定光吸收，

記為A對照管。

4. 測定管：取0.5 mL EP管，加入20μL粗酶液，40μL試劑三，混勻后置于30℃水浴保溫10min；加入40μL試劑二，混勻后8000g， 4℃離心10min；取40μL上清液，加入新的EP管，再加入200μL試劑四，40μL試劑五，混勻后置于30℃水浴保溫20min，取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板，于680nm測定光吸收，記為A測定管。（注意與空白管不同，先加試劑三，后加試劑二）

5. 空白管：取0.5 mL EP管，加入40μL蒸餾水，200μL試劑四，40μL試劑五，混勻后置于30℃水浴保溫20min，取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板，于680nm測定光吸收，記為A空白管。

6. 標(biāo)準(zhǔn)管：取0.5 mL EP管，加入40μL標(biāo)準(zhǔn)品，200μL試劑四，40μL試劑五，混勻后置于30℃水浴保溫20min，取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板，于680nm測定光吸收，記為A標(biāo)準(zhǔn)管。

注意：空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需要測定一次。

計(jì)算公式：

1. 按照樣本蛋白濃度計(jì)算

NP活性單位定義：30℃每毫克蛋白每分鐘水解產(chǎn)生1nmol酪氨酸為1個酶活單位。

NP活性（nmol/min /mg prot）= C標(biāo)準(zhǔn)品×（A測定管－A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）×V反總÷(Cpr×V1)÷T= 125×（A測定管－A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）÷Cpr

2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算

NP活性單位定義：30℃每克樣品每分鐘催化水解產(chǎn)生1 nmol酪氨酸為1個酶活單位。

NP活性（nmol/min /g鮮重）=C標(biāo)準(zhǔn)品×（A測定管－A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）×V反總÷（W×V1÷V2）÷T= 125×（A測定管－A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）÷W

3. 按照液體體積計(jì)算

NP活性單位定義：30℃每毫升樣品每分鐘催化水解產(chǎn)生1nmol酪氨酸為1個酶活單位。

NP活性（nmol/min/mL）=C標(biāo)準(zhǔn)品×（A測定管－A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）×V反總÷V1÷T= 125×（A測定管－A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）

4.         

5.        按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

NP活性單位定義：30℃每10⁴個細(xì)胞每分鐘催化水解產(chǎn)生1nmol酪氨酸為1個酶活單位。

NP活性（nmol/min /10⁴ cell）=C標(biāo)準(zhǔn)品×（A測定管－A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）×V反總÷（細(xì)胞數(shù)量×V1÷V2）÷T= 125×（A測定管－A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）÷細(xì)胞數(shù)量

C標(biāo)準(zhǔn)品：0.25 μ mol/mL標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液；V反總：酶促反應(yīng)總體積，0.1mL；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）；V1：加入反應(yīng)體系中粗酶液體積（mL），0.02 mL；V2：提取液總體積（mL），1mL；T：催化反應(yīng)時間（min），10min；W：樣品質(zhì)量（g）。

注意事項(xiàng)：

臨用前配制的試劑配制好后4℃保存，并且3天內(nèi)使用完畢。