雙縮脲法蛋白質含量測定試劑盒說明書

                                                微量法100T/96S

注    意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定，確保蛋白濃度在1～10mg/ml范圍內。

測定意義：

樣品可溶性蛋白質含量常常用于酶活性計算。此外，可溶性蛋白質含量也用于食品等質量分析。

測定原理：

強堿性溶液中，雙縮脲與CuSO₄形成紫色絡合物；紫色絡合物顏色的深淺與蛋白質濃度成正比，而與蛋白質分子量及氨基酸成分無關，故可用來測定蛋白質含量。該方法測定范圍為1~10mg蛋白質，適用于蛋白質濃度高的樣品，尤其是動物材料。

自備儀器和用品：

離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、移液器和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體20mL×1瓶，4℃保存。

標準品：液體1mL×1瓶，5 mg/mL，4℃保存。

樣品中可溶性蛋白質提取：

1.        液體樣品：澄清無色液體樣品可以直接測定。

2.        組織樣品：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液（自備，根據需要選用酶提取緩沖液或者蒸餾水或者生理鹽水））

冰浴勻漿，8000g，4℃離心10min，取上清，即待測液。（動物樣品常常需要稀釋）

3.        細菌、真菌：按照細胞數量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。

測定操作：

1. 分光光度計/酶標儀預熱30 min，調節波長到540 nm，蒸餾水調零。

2. 空白管：取0.5mL EP管，加入40μL蒸餾水，200μL試劑一，混勻后室溫靜置15 min，取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板，540nm比色，記為A空白管。

3. 標準管：取0.5mL EP管，加入40μL標準液，200μL試劑一，混勻后室溫靜置15 min，取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板，540 nm比色，記為A標準管。

4. 測定管：取0.5mL EP管，加入40μL待測液，200μL試劑一，混勻后室溫靜置15 min，取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板，540nm比色，記為A測定管。

注意：空白管和標準管只需測定一次。

樣品中蛋白質濃度計算公式：

C待測（mg/mL）= C標準管×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)

         =5×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)

注意事項：

1.樣品蛋白濃度須在1～10mg/ml范圍內，低于1mg/ml不能用此法，高于10mg/ml須做相應稀釋。因此測定前用1～2個樣做預實驗，確保蛋白濃度在1～10mg/ml范圍內。

2.待測樣品蛋白提取可用生理鹽水、雙蒸水或不含蛋白的PBS提取。該法受硫酸銨、Tris緩沖液干擾，提取液中應不含這些物質；否則改用BCA蛋白質含量測定試劑盒。